細胞粘附肽RGD 的液相合成的探究論文

　　精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸( Arg-Gly-Asp，RGD) 三肽是細胞粘附蛋白的識別位點，含有RGD 序列的多肽許多都具有抗粘附性能，可抑制腫瘤細胞與內皮細胞和基底膜的粘附，加速腫瘤細胞脫附，阻止腫瘤細胞滯留，從而抑制腫瘤細胞的轉移。1984 年，Pierschbacher 等首次確定了RGD 序列為人纖維連接蛋白與其受體的結合位點。1985 年，Hayman 等將含RGD 序列的4 個寡肽與無RGD 序列的5 個寡肽進行細胞粘附活性研究，發現含RGD 序列的肽有抑制正大鼠腎、變異的鼠腎、鼠BALB /C373、人骨肉瘤( MG63) 和人纖維素瘤( HT1080) 細胞的粘附作用，而無RGD 序列的5 個肽則沒有抗粘附活性。1987 年，Hynes報道，細胞表面存在與細胞粘附有關的ECM 糖蛋白受體，并將它們命名為整合蛋白。整合蛋白介導著許多種類的細胞與細胞及細胞與底物之間的相互作用，參與許多生物學過程，例如，體內平衡調節、吞噬作用、細胞遷移、細胞信號傳遞、淋巴細胞的識別、血小板的聚集等。由于許多病理學過程與正常的細胞外基質( ECM) 作用相關，含RGD 多肽或化合物有望用于某些疾病的治療。例如，將攜帶效應分子的RGD 肽與整合素αvβ3特異性結合，可以提高治療效應分子的靶向性。因此，該類肽的類似物成為藥物設計的一個新的靶點。綜上所述，研究RGD 序列肽的合成具有重要意義。

　　在本文中，首先，采用一種新穎的化學法( 氨解取代法) 合成了二肽Gly-Asp，再利用N-羧基內酸酐法合成了游離RGD 三肽，這種化學合成肽的方法與傳統上的化學法合成肽相比，具有高收率、低成本、合成量大的特點。

　　1 實驗部分

　　1. 1 主要儀器與試劑

　　RE52 旋轉蒸發儀( 上海亞榮生儀器廠) ; DHG-9070A 電熱真空干燥箱( 上海精宏實驗設備有限公司) ; Nicolet370 紅外光譜儀( 美國Thermo 公司) ;LCMS-2010EV 液相質譜聯用儀( 日本島津公司) 。L-天冬氨酸( L-Asp) 、甘氨酸( Gly) 、Z-精氨酸( Z-Arg) ，購自上海晶純化學公司; 乙酸乙酯、氯乙酰氯、氫氧化鈉、無水乙醇、無水硫酸鈉、四氫呋喃、三溴化磷、硼酸、四硼酸鉀、正辛醇、氫氧化鉀等均為市售國產分析純試劑。

　　1. 2 實驗方法

　　首先，將氯乙酰氯和L-Asp 在弱堿性條件下反應，然后使用濃氨水取代氯，合成GD 二肽( Gly-Asp) ，再利用N-羧基內酸酐法合成游離RGD 三肽。

　　1. 2. 1 L-Asp 的氯乙酰化將4. 8g L-Asp 與8mL 質量分數為27%的氫氧化鈉溶液混合，并調pH 在11 ～ 12 之間，再加入8mL 乙酸乙酯，于冰浴下攪拌。以相同的速度滴加5mL 氯乙酰氯和27%的NaOH 到上述溶液中，保持pH 在11 ～ 12之間。滴速不能太快，滴完后繼續攪拌30min。結束反應后用濃鹽酸調節pH = 1. 5，用乙酸乙酯萃取3 次，取上清液，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥過夜。減壓旋蒸除去乙酸乙酯，得到微黃色油狀物，靜置過夜。油狀物變為白色粉末。

　　1. 2. 2 氯乙酰化的L-Asp 氨解稱取所得的2. 0g 氯乙酰化L-Asp，加入12mL 濃氨水，冰浴下攪拌36h。減壓旋蒸上述反應液，得到微黃色的油狀物。加乙醇振蕩，除去醇溶物，出現微黃色不溶物。加熱旋蒸，得淡黃色粉末。記為GD 二肽

　　1. 2. 3 NCA-Arg 的制備將5mL 四氫呋喃與3g ZArg在室溫下激烈攪拌至完全溶解，加入5mL 三溴化磷與20mL 四氫呋喃的混合溶液。室溫攪拌3h后，反應液未分層，旋蒸除去溶劑后，得到黃色焦油狀物，真空干燥過夜

　　1. 2. 4 N-羧基內酸酐法合成RGD 三肽取1. 9g GD 二肽溶于pH = 10 的50mL 硼酸四硼酸鉀緩沖液體系( 0. 3g 硼酸+ 0. 1mol /L 50mL 四硼酸鉀1. 53g) 中。用氫氧化鉀調節pH 至10，加入1 滴辛醇，在激烈攪拌下一次加入一定量的NCAArg，并不斷加入氫氧化鉀保持pH = 10( 用pH 計監測) ，約5min，加入濃硫酸調pH 至5 終止反應。反應液旋蒸除去水后，凍干。用少量水溶解后用乙醇沉淀，得到白的粉末狀固體。

　　1. 2. 5 產物的結構表征將待測樣品溶于乙腈中，采用高效液相色譜儀進行檢測，采用5μm 的150mm × 4. 6mm 色譜柱，流動相為V乙腈∶ V水=80∶ 20，以1. 0mL /min 的.流速等度洗脫，上樣量20μL，柱溫為室溫，檢測波長λ = 220nm。

　　質譜檢測時，流動相為乙腈，流速為0. 3mL /min，上樣量5 μL。

　　紅外光譜檢測時，在瑪瑙研缽中，將待測樣品與KBr 按1 ∶ 150 比例混合，研磨均勻，壓成透明薄片。

　　2 結果與討論

　　2. 1 氯乙酰化天冬氨酸的結構表征

　　實驗制得白色粉末狀氯乙酰化天冬氨酸為6. 18g，產率約為82. 3%，經高效液相色譜檢測，其純度為95. 2%。氯乙酰化天冬氨酸經質譜分析，正離子圖譜中的[M + Na]+ = 231. 9，與理論值231. 57( 氯乙酰化天冬氨酸的理論分子量為208. 57) 吻合。

　　氯乙酰化天冬氨酸的紅外光譜圖見圖2。3211. 7cm - 1處的吸收峰歸屬為羧基中O—H 的伸縮振動，2972. 4cm - 1 歸屬為飽和C—H 特征吸收峰，1692. 7cm - 1歸屬為羧基中C = O 的特征吸收峰，1564. 4cm - 1歸屬為酰胺鍵的特征吸收峰。

　　在反應過程中，天冬氨酸的氨基在弱堿性條件下可以與氯乙酰化試劑發生反應，生成氯乙酰化天冬氨酸。此反應需在冰浴下進行，若溫度太高，副反應多; 若pH 降低，也會有氯乙酸副產物生成。本實驗選用水和有機相的混合溶劑，不僅可以減少水解副反應的發生，還可使生成的產物轉移到有機相，促進反應發生。

　　2. 2 GD 二肽的結構表征

　　實驗制得淡黃色粉末狀GD 二肽為1. 55g，產率約為84. 8%。經高效液相色譜檢測，其純度為98. 6%。GD 二肽的高效液相譜圖。

　　經質譜分析，GD 二肽的理論分子量是190. 07，[M + H]+ = 191. 07，所合成的樣品的正離子圖譜中的[M + H]+ = 191. 1 與理論值一致。GD 二肽紅外分析結果所示，在3450. 3 和3370. 4 cm - 1 出現的雙峰，歸屬為氨基的特征吸收峰，1690. 7cm - 1 的峰歸屬為羧基中C 匫的特征吸收峰，1619. 0cm - 1處是酰胺鍵的特征吸收峰。

　　在氯乙酰化天冬氨酸氨解生成二肽的過程中二肽可能與多余的氨水發生副反應，太短反應不完全，太長副反應多，所以反應時間取為36h。反應后要立即旋蒸除去氨氣。由于反應放熱，低溫有利于產物產率的提高，所以也需在冰浴下反應。

　　2. 3 RGD 三肽的結構表征

　　實驗制得白色粉末狀RGD 三肽為2. 47g，產率約為71. 4%。經高效液相色譜檢測，其純度為94. 2%。

　　RGD 三肽的質譜分析的正離子圖譜中的[M+ H]+ = 346. 1，與理論值[M + H]+ = 346. 3( RGD 三肽的理論分子量為345. 3) 吻合。RGD 三肽的紅外分析結果，其中，3420. 3cm - 1 的峰歸屬為氨基的特征吸收峰，1674. 9 和1619. 0 cm - 1 的峰分別歸屬為羧基中匔=O 和精氨酸中胍基 C=N 的特征吸收峰。

　　RGD 三肽合成中，應該注意以下兩點: 第一，在NCA-Arg 的制備中，控制催化劑溶液的溫度非常重要，一定要保持催化劑溶液溫度在0℃以下，因為三溴化磷( PBr3) 具有揮發性，溫度升高會使三溴化磷揮發，而失去催化活性; 第二，在RGD 三肽的合成中，需控制反應在低溫條件下進行。已經知道，N-羧基在0℃下穩定，在室溫下則易于分解放出CO2; 此外低溫有利于氨解反應而不利于NCA 的水解和形成NCA 負離子。另外，需嚴格控制反應在pH = 10 下進行，pH 過低會使N-羧基脫羧而同NCA 反應造成酸催化; 但pH 過高，不僅會使NCA 發生水解，而且還會導致通過形成NCA 負離子而發生的堿催化過頭或形成尿素衍生物。采用高速攪拌使反應物能夠快速地均勻混合，因為在反應過程中，會有少量NCA 負離子存在，如攪拌速度較慢，會造成NCA 周圍的氨基酸濃度較小，從而導致NCA 同NCA 負離子反應產生副產物。

　　3 結論

　　隨著RGD 肽類藥物的廣泛應用和深入研究，有關RGD 肽類的合成越來越顯示其重要性和潛在的市場價值。本文使用液相合成法成功合成出RGD 三肽。首先以天冬氨酸為原料在pH = 11 ～12 之間、冰浴條件下進行氯乙酰化，得到中間產物，然后在冰浴條件下與25% ～ 28% 氨水進行氨解反應，得到GD 二肽，最后利用NCA 法合成三肽。此方法具有高收率、低成本、合成規模大的特點。

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