淺析大鼠CRH基因干擾慢病毒載體的構建論文

　　促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)由下丘腦室旁核(PVN)合成，促進腺垂體合成與釋放促腎上腺皮質激素(ACTH)。CRH 作為應激反應的中樞起始調節因子之一，在應激時含量明顯增高。Plotsky等觀察到大鼠新生期母嬰分離引起的應激模型中PVN內CRH mRNA及CRH 受體1(CRH-R1)表達明顯增多。RNA干擾(RNAi)是一種通過降解靶基因mRNA使靶基因表達減少或沉默的技術，再結合慢病毒載體技術就實現了長期、穩定的基因沉默效應。本實驗旨在篩選CRH 基因的RNAi有效靶點，構建和鑒定CRH 基因RNAi的慢病毒載體，為后期研究CRH 神經元敏感化在應激反應中的作用及機制奠定基礎。

　　材料與方法

　　一、材料

　　包裝細胞293T細胞株(吉凱基因公司);大腸桿菌菌株DH5α、DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司);pEGFP-N1-3FLAG Vector(BD 公司);EcoRⅠ/BamHⅠ內切酶(上海吉凱基因化學技術有限公司);限制性內切酶、T4DNA連接酶(NEB公司);質粒DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA 純化試劑盒(Qiagen公司);Mouse Anti-flag(1∶3000)(Sigma公司)。

　　二、方法

　　1.CRH 基因過表達質粒構建

　　載體GV143質粒XhoⅠ/KpnⅠ酶切后，化學合成目的基因。用XhoⅠ/KpnⅠ酶切化學合成的含有目的基因的質粒，酶切產物電泳回收后進行定向連接，其產物轉化DH5α大腸桿菌。選擇單克隆進行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序(上海吉凱基因化學技術有限公司)，比對正確的克隆即為構建成功的過表達質粒。用于菌落PCR鑒定轉化子的引物為：(1)CMV-F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′;(2)EGFP-N-R：5′-CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3′。

　　2.RNAi病毒載體質粒構建

　　針對CRH mRNA(NM_031019)，設計并合成4對針對CRH基因的小干擾RNA(siRNA)的核苷酸序列，同時設計并合成一段無意義序列作為陰性對照。挑取陽性克隆送至上海吉凱基因化學技術有限公司測序鑒定，構建的4種干擾質粒分別命名為KD1、KD2、KD3和KD4。該RNAi病毒載體可同時表達綠色熒光蛋白(GFP)，用于判斷轉染效率。根據Invitrogen公司的Lipofectamine 2000使用說明共轉染培養好的工具細胞293T細胞。

　　3.CRH基因RNAi有效靶序列篩選

　　分為三組：NC組共轉染過表達質粒和陰性對照病毒載體質粒作為陰性對照;CON 組為不轉染任何質粒的293T細胞;KD組共轉染過表達質粒和RNAi靶點病毒載體質粒(分為KD1、KD2、KD3、KD4，分別含有針對目的基因的不同干擾靶點序列的RNAi病毒載體質粒)。轉染后24h熒光顯微鏡下觀察轉染效果，轉染后36h收集細胞抽提蛋白，使用抗GFP抗體Western blot法檢測目的基因的表達情況，進而判斷不同靶點的干擾效果。

　　4.病毒包裝

　　293T 細胞培養至活細胞達70%-80%時轉染篩選出的干擾質粒和DNA溶液。把稀釋后的干擾質粒和DNA混合液與稀釋后的Lipofectamine 2000于5min內混合，室溫溫育20min，于37℃細胞培養箱中培養。8h后倒去含有轉染混合物的培養基，每瓶細胞加入20ml的PBS液，棄洗液。每瓶細胞中加入含10%胎牛血清的細胞培養基25ml，培養箱內繼續培養48h。收集轉染48h的293T細胞上清液，于4℃、4000 g離心10min，收集上清液;將上清液以0.45μm濾器過濾后置于40ml超速離心管中，4℃、4000 g 離心10-15min，將病毒濃縮液移出。

　　5.病毒生物學滴度測定

　　測定前1d在96孔板鋪板，每孔加4×104 個293T細胞，體積為100腳莀__M_μl。用系列稀釋的制備的病毒載體分別加入96孔培養板。24h后加入完全培養基100μl。4d后熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。根據熒光圖片中GFP表達情況，計數最大稀釋倍數孔中的帶有熒光的細胞個數，計算病毒滴度(TU/ml)=(熒光細胞個數×轉染時細胞數/100×每孔加入病毒稀釋液體積)×1/稀釋濃度。

　　結果

　　一、CRH 基因過表達質粒構建

　　CRH 基因過表達質粒構建GV143載體進行XhoⅠ/KpnⅠ酶切。化學合成目的.基因，用XhoⅠ/KpnⅠ酶切化學合成的含有目的基因的質粒得到565bp的片段，將其連入酶切載體中。挑單克隆PCR得到845bp的特異性條帶。送200μl進行測序，測序結果與目標序列完全一致，表明CRH基因過表達質粒構建成功。將CRH 基因過表達質粒轉染293T細胞，收集細胞總蛋白。通過Western blot檢測轉染293T的樣品，可以觀察到49kD附近處有特征條帶，其大小和目的基因融合蛋白相比大小相符(見內頁4圖4)。轉染24h后，熒光顯微鏡下觀察轉染效果。

　　二、CRH 基因RNAi有效靶序列篩選

　　重組克隆載體PCR鑒定、測序，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，連接入短發夾RNA(shRNA)的片段的陽性克隆PCR的片段大小為340bp;沒有連接入shRNA的片段的空載體克隆PCR片段大小為299bp。經測序分析后確認插入序列正確，說明GV143-CRH中已含有siRNA 模板DNA的片段。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳。轉染24h后，熒光顯微鏡下觀察轉染效果。從Western blot結果可以看出，KD2、KD3、KD4靶點對CRH 基因的表達有敲減作用，是有效靶點。我們選擇KD2靶點(siRNA 序列5′-TCAGGAAACTGATGGAGATTATCTCGAGATAATCTCCATCAGTTTCCTGTTTTTTC-3′)進行CRH 基因RNAi慢病毒表達載體的構建。

　　三、病毒包裝及生物學滴度測定

　　干擾質粒和輔助質粒共轉染293T細胞后在熒光顯微鏡下發出綠色熒光。病毒原液滴度為1.5×109 TU/ml，表明我們已成功構建了高滴度的慢病毒載體，病毒成功包裝。

　　討論

　　1981年Vale從綿羊下丘腦中分離出調節ACTH釋放的肽，即CRH。CRH 不但在腦組織中分布廣泛，也可廣泛分布于中樞及外周神經組織，中樞內以下丘腦含量最高，主要分布于PVN的小細胞中，在其他神經核團中也分布有少量CRH。CRH 調節下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)，參與應激反應。CRH是通過CRH-R起作用的，CRH-R在腦的不同部位均有表達，目前已知的CRH-R有CRH-R1、CRH-R2和CRH-R3三種亞型。Hsu等報道急性應激可引起大鼠丘腦CRH mRNA水平增高，而重復應激不改變CRH mRNA水平，阻斷急性應激所誘導的CRH mRNA水平增高的效應。慢性應激時，CRH神經元胞體增大，接受谷氨酸能及去甲腎上腺素能傳入神經纖維增多，CRH 釋放增加。

　　RNAi技術是一種通過觸發同源RNA 降解使目的基因沉默的技術，由于具有特異性、高效性、多能性而被廣泛應用。RNAi技術可以利用siRNA或siRNA表達載體快速、經濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現在已經成為探索基因功能的重要研究手段。同時嵌入慢病毒載體技術，使目的基因整合到宿主的DNA序列，慢病毒介導的基因表達或RNAi干擾作用持續且穩定。與其他病毒載體相比，擴大了載體感染細胞的范圍，適用于體內基因治療，為研究基因功能提供了更強有力的工具。本實驗在確定CRH 基因存在于PVN的前提下，用Oligoengine軟件，設計出GC含量在45%-55%的4個shRNA 序列及一個陰性對照序列，連接慢病毒載體GV118，測序鑒定后，將構建重組的載體和慢病毒包裝質粒共同轉染293T細胞，然后通過實時PCR靶點篩選出有效的干擾序列。經Western blot和實時PCR的鑒定成功構建了CRH 的RNAi慢病毒載體，293T細胞包裝后產生了高滴度的病毒顆粒。本實驗為研究PVN 內CRH神經元敏感化在應激反應中的作用及進一步研究CRH 基因功能打下了基礎。

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