分析D3形態學低評分胚胎囊胚形成的影響因素論文
隨著序貫培養系統的不斷完善，形態學低評分胚胎的利用價值日益受到關注。已有報道形態學低評分胚胎經體外繼續培養仍有一部分能發育成囊胚，且移植這些由取卵后第3天(D3)形態學低評分胚胎培養而來的囊胚最終獲得妊娠，并且可以利用這類形態學低評分胚胎建立人類胚胎干細胞(human embryonic stem cell)系用于研究。已有很多文獻報道了胚胎形態與低評分胚胎囊胚形成的關系，但對形態學低評分胚胎囊胚形成的相關臨床因素卻很少涉及，本研究通過對影響低評分胚胎囊胚形成的相關臨床因素及胚胎因素進行分析，為如何挑選低評分胚胎繼續培養以及提高囊胚形成率及質量提供理論支持和數據參考。
1 對象與方法
1.1 研究對象
收集2012年4月—2012年12月在本生殖中心行常規體外受精/胞漿內單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSIET)治療且滿足以下納入標準的所有患者：①第1個IVF/ICSI-ET治療周期。②采用黃體中期降調的長方案。③新鮮周期移植2個或3個優質胚胎后還有剩余的低評分胚胎行囊胚培養，移植優質胚胎后若還有剩余的優質胚胎則進行玻璃化快速冷凍保存。經患者知情同意后將低評分胚胎移入囊胚培養液中繼續培養觀察，記錄囊胚發育情況，有囊胚形成者根據囊胚質量選擇凍存或丟棄。422個周期共有1 745個低評分胚胎進行了繼續囊胚培養。
1.2 實驗方法
1.2.1 胚胎培養及評估
按Peter卵裂期胚胎評分系統評估D3胚胎質量[4]。Ⅰ級：卵裂球大小一致，胞質均勻，細胞碎片<10%;Ⅱ級：卵裂球大小一致，胞質均勻，10%≤細胞碎片≤20%;Ⅲ級：卵裂球大小不一致，胞質不均勻，細胞碎片<10%;Ⅳ級：卵裂球大小不一致、胞質均勻，20%<細胞碎片≤40%，或卵裂球大小不一致，胞質不均勻，10%≤細胞碎片≤20%;ⅴ級：細胞碎片>40%;Ⅵ級：全碎片。D3有7～8個細胞數的Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優質胚胎，其余D3胚胎為形態學低評分胚胎。
1.2.2 囊胚培養及評分
將低評分胚胎移至預先平衡好的G2培養液微滴中培養至5～7 d，觀察胚胎發育情況，根據Gardner囊胚評分系統[5]對囊胚進行評分，將D5和D6評分≥3BB囊胚定為優質囊胚。
1.2.3 評價指標
主要觀察指標：觀察囊胚形成率及優質囊胚形成率。
1.3 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件包進行統計學分析，結果以百分率表示，率的比較采用χ2檢驗，顯著性檢驗水準為α=0.05;組內兩兩比較按照χ2分割法，則分3組中的`兩兩比較的檢驗水平為0.0125。
2 結果
2.1 囊胚形成情況
本研究共收集422個取卵周期1 745個低評分胚胎進行囊胚培養，共形成囊胚1 046個，囊胚形成率為59.9%，其中優質囊胚為763個，優質囊胚形成率為43.7%。
2.2 年齡、基礎竇卵泡數及基礎卵泡刺激素(bFSH)與囊胚形成的關系
年齡≤35歲組的優質囊胚形成率高于年齡>35歲組，差異有統計學意義(P<0.01)，而2組的囊胚形成率差異無統計學意義(p>0.05)。患者基礎竇卵泡數、bFSH各自組間的囊胚形成率及優質囊胚形成率差異均無統計學意義(P>0.05)。
2.3 促性腺激素(Gn)總劑量、人絨毛膜促性腺激素(hCG)日雌二醇(E2)水平、獲卵數與囊胚形成的關系
隨著Gn總劑量的增大，囊胚形成率及優質囊胚形成率逐漸降低，但組間囊胚形成率及優質囊胚形成率差異均無統計學意義(P>0.05)。根據hCG日E2水平將患者分3組，3組間的囊胚形成率及優質囊胚形成率差異均無統計學意義(P>0.05)。獲卵11～20個組的囊胚形成率及優質囊胚形成率最高，獲卵≤10個組的囊胚形成率及優質囊胚形成率最低，但各組間囊胚形成率及優質囊胚形成率差異均無統計學意義(P>0.05)。
2.4 D3卵裂細胞數、胚胎碎片與囊胚形成的關系
D3卵裂細胞球數為4～6個組的囊胚形成率及優質囊胚形成均最低，與卵裂細胞數為7～9個、10～14個組相比差異均有統計學意義(P<0.012 p="">0.012 5)。D3胚胎碎片≤10%組的囊胚形成率及優質囊胚形成率高于碎片為20%～25%組，≤10%組優質囊胚形成率高于10%<碎片<20%組，差異有統計學意義(P<0.012 p="">0.012 5)。
3 討論
囊胚的形成受多種因素的影響，單獨依據形態學評分來衡量囊胚的形成情況有一定局限性，所以在挑選低評分胚胎進行囊胚培養時，對囊胚形成的影響因素應該了解。探討低評分胚胎囊胚形成的影響因素可為優質胚胎行囊胚培養提供一些理論依據及參考價值，從而提高囊胚形成率及質量，使更多的患者可選擇單優質囊胚移植，提高妊娠率的同時又減少多胎率，且可利用低評分胚胎形成囊胚建立胚胎干細胞系用于科研，為胚胎干細胞提供更多的資源。另外低評分胚胎囊胚形成情況監測可作為實驗室質量控制的一個常規項目，其對人類胚胎體外培養系統穩定性的衡量更為直接和準確。
3.1 年齡、基礎竇卵泡數、bFSH與囊胚形成的關系
眾所周知年齡、基礎竇卵泡數、bFSH對卵巢儲備功能的預測有重要意義，但有關年齡、基礎竇卵泡數、bFSH對低評分胚胎囊胚形成的影響卻鮮有報道。有研究發現，隨女性年齡增大，胚胎染色體異常發生風險增高，特別是年齡>35歲時尤為明顯[7]。另有研究顯示，女性年齡的增長對囊胚擴張及孵化程度及滋養外胚層(TE)質量有負面影響[8]。本研究顯示≤35歲組與>35歲組相比囊胚形成率差異無統計學意義，但優質囊胚形成率差異有統計學意義，提示年齡影響囊胚質量。本研究還顯示基礎竇卵泡數、bFSH對囊胚形成率及優質囊胚形成率沒有明顯影響，可能基礎竇卵泡數及bFSH只與儲備功能有關，影響獲卵數及形成胚胎數，但不影響囊胚及優質囊胚形成率。
3.2 Gn總劑量、hCG日E2、獲卵數與囊胚形成的關系
有研究顯示溫和的卵巢刺激可以減少早期卵裂的錯誤，可以得到更多的優質胚胎移植。同時有研究提示Gn總劑量水平與囊胚質量呈負相關。Thomas等研究顯示優質囊胚的形成與Gn用量成反比，本研究結果與此結果相似，發現隨著Gn用量的增加，囊胚形成率及優質囊胚形成率有降低趨勢，但組間差異無統計學意義，可能是本研究中囊胚只來源于低評分胚胎及樣本量不足的原因所致。Thomas等研究提示囊胚形成與促排卵第8天E2水平無關，與本研究結果相似。還有研究顯示獲卵數與TE質量呈負相關，但本研究結果提示囊胚形成率及優質囊胚形成率在獲卵數≤10個、11～20個、>20個的組間差異均無統計學意義。
3.3 D3卵裂細胞數、胚胎碎片與囊胚形成的關系
大量的研究表明胚胎卵裂的快慢影響囊胚的形成。Wang等的研究顯示7～9細胞組的胚胎囊胚形成率高于細胞≤6細胞組的囊胚形成率(P<0.05)，但與≥10細胞組的差異無統計學意義。溫烯等的研究報道細胞數<8個時，隨著細胞數增加，囊胚形成率有升高趨勢，當細胞數>8個時囊胚形成率不再升高。但Racowsky等[13]發現卵裂速度較快及中等的胚胎其囊胚形成率顯著高于卵裂速度緩慢的胚胎，且D3胚胎卵裂細胞數越多，胚胎發育速度越快，則其優質囊胚形成率就越高。本研究結果為臨床囊胚培養提供參考：卵裂細胞數≥7個組的低評分胚胎囊胚形成率及優質囊胚形成率均高于卵裂細胞數為4～6個組，隨著卵裂細胞數的增加，其囊胚形成率及優質囊胚形成率亦增加，但7～9個組與≥10個組相似。胚胎碎片會影響細胞之間的連接，干擾細胞的融合、囊腔和囊胚的形成;隨著胚胎碎片的增多，囊胚形成率降低，囊胚的細胞數目尤其是TE數目減少。
本研究結果顯示，碎片≤10%的胚胎優質囊胚形成率高于碎片>10%的胚胎，10%<碎片<20%的胚胎與20%～25%的胚胎囊胚形成率及優質囊胚形成率相似。
綜上所述，低形態學評分胚胎有繼續發育潛能及繼續發育的能力。很少有文獻涉及臨床因素對低評分胚胎囊胚形成率的影響，本研究顯示D3卵裂細胞數、D3胚胎碎片顯著影響低評分胚胎的囊胚形成，其中年齡、D3卵裂細胞數、D3胚胎碎片影響低評分胚胎的優質囊胚形成。
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